Визуализация стала еще доступнее! Красители с короткими сроками поставки (Lumiprobe, Россия)

Диаэм совместно с компанией Lumiprobe расширяет линейку флуоресцентных красителей для ваших исследований. Доставка данных красителей осуществляется в течение 30 дней!

Флуоресцентные красители (также известные как флуорофоры/реактивные красители) молекулы (небелковые по своей природе) способные поглощать свет с заданной длиной волны и излучат его на другой длине волны. Это явление можно визуализировать и анализировать, используя флуоресцентный микроскоп или гель-док систему.

В результате чего красители часто используют для флуоресцентного мечения различных биомолекул (антител, пептидов, различных белков и т. д.) для таких процессов, как мониторинг доставки лекарств в ткани-мишени, визуализация и другие.

Реагент H₂DCFDA (2′,7′-Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

H₂DCFDA представляет собой нефлуоресцирующее производное флуоресцеина — его восстановленную ацетилированную форму. Реагент начинает флуоресцировать только после отщепления ацетильных групп и окисления внутри клетки, превращаясь в 2′,7′-дихлорофлуоресцеин. Он характеризуется флуоресценцией в зеленой области спектра (максимум поглощения при 511 нм, максимум флуоресценции при 533 нм). Реагент подходит для исследования живых клеток и не совместим с фиксацией образцов.

Ацетильные группы в структуре H₂DCFDA повышают его липофильность и улучшают проникающую способность реагента через клеточную мембрану. Попадая внутрь клетки, он деацетилируется клеточными эстеразами, из-за чего приобретает заряд и лучше удерживается внутри клетки. Окисление активными формами кислорода приводит к образованию флуоресцирующего продукта — 2′,7′-дихлорофлуоресцеина и может быть детектировано различными способами, например, с помощью проточного цитометра, планшетного ридера или флуоресцентного микроскопа.

Информация для заказа:

Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF488, и PI.

Методы использования набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

• Окрашивание клеток:
  
  
  1. Адгезированные клетки аккуратно снимите с поверхности роста подходящим способом. С суспензионными клетками начинайте работу со следующего пункта.
     
     
  2. Промойте клетки один раз охлаждённым PBS (рН7.4) и один раз 1х буфером для связывания.
     
     
  3. Ресуспензируйте клетки в холодном 1х буфере для связывания.
     
     
  4. Отберите 100 мкл суспензии клеток (от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для проточной цитометрии необходимо заготовить дополнительные пробирки с соответствующими контролями (см. описание контролей ниже).
     
     
  5. Добавьте 2-5 мкл раствора аннексина V-AF488 в каждую пробирку, инкубируйте в течение 10-15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
     
     
  6. Без предварительной отмывки добавьте 400 мкл 1x буфера для связывания в каждую пробирку.
     
     
  7. (Опционально) Добавьте 5 мкл йодистого пропидия в каждую пробирку с клетками. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
     Важно! Не промывайте клетки от йодистого пропидия. Йодистый пропидий должен оставаться в буфере во время сбора данных.
     
     
  8. Окрашенные клетки храните при температуре 2-8°C в защищенном от света месте до проведения анализа.
     Важно! Количественное определение клеток методом проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии необходимо производить в течение 4 ч от начала окрашивания из-за негативного воздействия йодидистого пропидия на жизнеспособность клеток.
     
     
     
• Проточная цитометрия:
  
  
  1. Для цитофлуориметрического анализа апоптоза и некроза клеток с помощью аннексина V-AF488 и йодистого пропидия помимо целевого окрашивания необходимо приготовить контроли: неокрашенные клетки (отрицательный контроль для настройки прибора); клетки, окрашенные только аннексином V-AF488, и клетки, окрашенные только йодистым пропидием (для настройки компенсации).
     
     
  2. Анализ связывания аннексина V-AF488 проводят с использованием детектора сигнала FITC.
     
     
  3. Анализ клеток, окрашенных йодистым пропидием, осуществляют с помощью детектора сигнала фикоэритрина.
     
     
     
• Флуоресцентная микроскопия:
  
  
  1. Отберите каплю суспензии с окрашенными клетками и поместите ее на предметное стекло. Накройте клетки покровным стеклом.
     
     
  2. В качестве альтернативы, адгезированные клетки можно окрашивать непосредственно на покровном стекле. После окрашивания переверните покровное стекло на предметное, так, чтобы клетки находились между предметным и покровным стёклами.
     
     
  3. (Опционально) Клетки после окрашивания аннексином V, перед визуализацией можно промыть 1х буфером для связывания и зафиксировать в 2% параформальдегиде. Не фиксируйте клетки перед инкубацией с аннексином V-AF488, поскольку любое нарушение клеточной мембраны может вызвать неспецифическое связывание аннексина V с ФС на внутренней поверхности клеточной мембраны.
     
     
  4. Исследование клеток под флуоресцентным микроскопом осуществляют, используя двойной набор фильтров для FITC и родамина.

Информация для заказа: